如和确定PCR反应的退火温度和延长时间
来源:学生作业帮助网 编辑:作业帮 时间:2024/08/10 10:55:49
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58C,如果是有模板的话,58C或再低一些都可以,其实退火温度不需要刻意去要求,一般的PCR,52-60C就可以全解决.
这篇文章有详细描述:http://www.springerlink.com/content/h083177466217382/引物OY1(AATAACTTTTCGAATCGCAT)OY2(AAGACT
在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还要足够高,以减少非特异性结合.合理的退火温度从55℃到70℃.退火温度一般设定比引物的Tm低5℃.详细的还是看看下面这个网站希望能帮到
退火温度是影响PCR反应特异性的重要因素.引物与模板复性所需要的退火温度取决于引物的长度、碱基组成及其浓度.引物长度越短,引物中G+C的含量越低,所需的退火温度越低.虽然降低退火温度可能增加扩增产量,
退火温度基本和引物有关,如果产物特异性不好,可以适当提高退火温度.循环次数是你自己定的,如果模板量低(产物量少)就多循环几圈,不过最好别超过35个,里边的成分都耗损的差不多了.再循环也没大用了.
不同的PCRMIX所设置的退火温度是不一样的,有的比最低Tm值低5℃,有的低3℃,请你参考你所买的PCRMIX的说明书,上面肯定有详细说明.一般PCR比最低Tm值低1-5℃,都没什么问题.RT-PCR
退火温度与引物的TM值的关系主要和DNA聚合酶与其buffer有关.有些退火温度要比TM低5度、3度,有些还会高3度,有些是一模一样的.主要参考不同公司所生产的DNA聚合酶的说明书.
荧光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用来检测基因的表达量的,但二者检测的东西多少有些不同.荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入可以和双链DNA特异性结合的荧光染料(sybrgreen)或者和目的
计算退火温度的方法:1.退火温度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5~8)只是粗算,有时不灵,但比较简便.2.用primer5(oroligo6)计算,引物配对好后,primer5可以显示Tm,我认
分别摸索实验条件测定,根据DNA电泳判断不过其实在做PCR的时候,根据合成的引物中的GC含量可以用公式计算出退火温度,一般比GC计算出的公式低5度比较合适
你做个退火温度的梯度吧!大部分的PCR都有这一功能!退火温度选择一个范围,如50-60度,PCR仪器在一排(12个孔)或一列(8个孔)中每个孔的温度都不同,你在相应的孔中放入待反应的PCR混合液(保证
可尝试45-70度设个梯度退火,P一次就知道哪个温度最适合.如没有梯度退火的PCR仪,则可试试两个Tm值中间的温度,一般较多在50、55度可P出来.你试试吧.
退火温度递减的PCR程序叫:降落PCR
TM值是在一定buffer盐浓度情况下计算出来的.你需要查一下你的PCR体系里buffer盐的浓度,然后找相应的TM值.不过TM值也是一个估算值,举个例子,以你的正向引物而说,TTACAAGATGGA
软件终归是软件,一个PCR体系的具体反应条件不通过实际运行是无法得知最佳退火温度的.建议你做一个梯度PCR摸索一下最佳退火温度.
1、软件预算2、利用梯度PCR优化退火温度
一般用55°,不行的话用58°,再不行的话就设置从58-55的touchdown
引物的另一个重要参数是熔解温度(Tm).这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的.在理想状态下,退火温度足够低,以保证引物同目的序列有效退火,同时还
一般认为Tm-5度.但是要看你的Tm计算方法,不同公司合成的引物得出的Tm都不一样,你可以做个梯度PCR看看最适退火温度,以后就有经验了.
计算退火温度的方法:1.退火温度=4×(G+C)+2×(A+T)-(5~8)只是粗算,有时不灵,但比较简便.2.用primer5(oroligo6)计算,引物配对好后,primer5可以显示Tm,我认