请教关于荧光共振能量转移(FRET)中的标记方法有哪些?请不要给我讲FRET技术.
来源:学生作业帮 编辑:百度作业网作业帮 分类:生物作业 时间:2024/08/17 18:39:45
请教关于荧光共振能量转移(FRET)中的标记方法有哪些?请不要给我讲FRET技术.
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每个研究问题都有特定的标记方法,目标当然是能够满足FRET的条件.
下面给出几个例子:
二、FRET技术的应用
随着生命科学研究的不断深入,对各种生命现象发生的机制,特别是对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用的研究变得尤为重要.而要想在这些方面的研究取得重大突破,技术进步又是必不可少的.一些传统的研究方法不断发展,为蛋白质-蛋白质间相互作用的研究提供了极为有利的条件,但同时这些研究手段也存在不少缺陷:如酵母双杂交、磷酸化抗体、免疫荧光、放射性标记等方法应用的前提都是要破碎细胞或对细胞造成损伤,无法做到在活细胞生理条件下实时的对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究.FRET技术的应用结合基因工程等技术正好弥补了这一缺陷,下面是FRET技术在相关生命科学领域中的具体应用.
1、检测酶活性变化
(1)活细胞内检测蛋白激酶活性
蛋白质磷酸化是细胞信号转导过程中的重要标志,研究其中的酶活性是研究信号通路的一个重要方面.以前酶活性测定主要是利用放射性以及免疫化学发光等方法,但前提都是要破碎细胞,用细胞提取物测定酶活性,还无法做到活细胞内定时、定量、定位的观测酶活性变化.而利用FRET方法就可以很好的解决这个问题:如zhang等人利用FRET原理设计了一种新的探针(一种融合蛋白):新探针包含一个对已知蛋白激酶特异性的底物结构域,一个与磷酸化底物结构域相结合的磷酸化识别结构域.这个探针蛋白的两端是GFP的衍生物CFP与YFP,利用FRET原理工作.当底物结构域被磷酸化后,分子内部就会发生磷酸化识别结构域与其结合而引起的内部折叠,两个荧光蛋白相互靠近就会发生能量迁移.如果磷酸酶进行作用将其去磷酸化,分子就会发生可逆性的变化.该研究小组[3-4]用几组嵌合体来研究四种已知蛋白激酶的活性:PKA(protein kinase A)、Src、Abl 、 EGFR(epidermal growth factor receptor).他们将构建的报导探针转入细胞,根据FRET来检测激酶活性变化.对细胞进行生长因子处理后,几种酪氨酸激酶都在几分钟内被激活,检测到25%-35%的活性变化.用forskolin激活PKA能增强FRET 25%-50%的变化,激酶在整个细胞质范围内被激活.如果将报导探针加上核定位信号使之定位于核中,则FRET变化被极大的延迟了,这也说明了PKA作用的区域性.由此可见,利用FRET方法可以很好的观察活细胞内酶活性变化,并且能做到定时、定量、定位,是一种非常有效的研究手段.
(2)关于细胞凋亡的研究
细胞凋亡过程大致可以分为三个不同的阶段:起始期—细胞通过不同途径接受多种与凋亡有关的信号;整合期—多种信号在此整合,细胞做出生存或死亡的决定;执行期—一旦做出死亡的决定,即将进入一个不可逆转的程序.天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease,Caspase)在细胞凋亡的执行期发挥关键作用,近年来对其研究成为细胞凋亡领域的一个热点.而FRET技术的出现对此的研究提供了更为有利的条件:Reiko Onuki等人利用FRET技术研究了Caspase8与Bid蛋白之间的相互作用,Caspase8活化后作用Bid蛋白,使其裂解成两个片段,然后羧基片段转移到线粒体使其释放细胞色素C诱发细胞凋亡.研究者将Bid蛋白两端分别与CFP与YFP融合,精心设计使其在没有被裂解前刚好可以发生FRET,当Bid蛋白被裂解后FRET效应自然消失.所以是一种很好的检测Caspase8酶活性方法,而且当Bid蛋白与CFP与YFP融合之后仍能行使正常的功能,当融合物在细胞内被裂解后,连接CFP的片段转移到线粒体,通过CFP荧光可以很清楚的观测到其在细胞内的定位.另外Markus Rehm[6]与 Kiwamu Takemoto[7]等人利用FRET技术设计了可以反映Caspase3酶活性变化的融合报告蛋白,通过此报告蛋白证实了在细胞凋亡过程中Caspase3酶活性变化是一个非常迅速的过程.
2、关于膜蛋白的研究
(1)受体激活效应在细胞膜上的横向扩散
膜蛋白的研究一直都是信号通路研究中的重点和难点.当细胞膜局部受外界刺激后,相应受体被激活然后向细胞内传导信号,可是在这之前是否会有细胞膜上的横向效应呢?近来Peter等人[8]在Science上报道:细胞膜局部受刺激后,膜受体活化效应可迅速扩展到整个细胞膜.他们将膜受体EGFR(epidermal growth factor receptor)与GFP融合,抗活化后的EGFR抗体用Cy3染料标记,刺激因子EGF(epidermal growth factor)用Cy5染料标记,这样可以很明显的看到EGF在细胞膜上的局部分布.当EGF作用细胞后,EGFR活化并与其抗体结合,于是GFP与Cy3染料充分接近发生FRET,利用此方法可以很明显的观测到细胞膜局部受刺激后,受体活化效应迅速扩散到整个细胞膜.
(2)膜蛋白的定位修饰
我们知道膜蛋白是定位在细胞膜上不同的亚区域中,例如脂质筏(lipid rafts)和小窝(caveolae),小窝包含着丰富胆固醇、鞘磷脂和信号蛋白.那么这些蛋白怎样到达它们的目的地呢?Zacharias等在Science上报道,酰基化足以使这些蛋白定位在脂质筏.他们的研究是通过FRET(fluorescence resonance energy transfer)技术,用GFP的突变体CFP(cyan fluorescent protein)和YFP(yellow fluorescent protein)来进行.因为这些蛋白并没有细胞内定位序列,所以研究者将各种酰基化修饰的敏感序列加在这些蛋白上,研究它们在细胞膜上的分布.因为分布的微结构域非常小,所以当CFP和YFP共分布在同一个微结构域时,就可以用FRET来观测到.研究者最初是用激酶Lyn的酰基化序列加在这些荧光蛋白上,使myristoyl和palmitoyl侧链链接在CFP和YFP的氨基端.结果发现产生的FRET信号非常强,用能去除胆固醇而使小窝和脂质筏消失的MCD(5-methyl-β-cyclodextrin)处理也不能使荧光消失,所以这说明荧光蛋白已经非常牢固的结合在了一起.然后研究者用荷电的基团代替荧光蛋白上疏水的基团时,发现聚体形成被抑制了.
3、细胞膜受体之间相互作用
外界刺激因素向细胞内的信号传递一般认为通过其在胞膜上的受体,当配体与受体结合后,引起受体构象变化或化学修饰,介导信号传递.但是最近关于Fas及其同源物TNFR(均为胞膜上的三聚体受体)的研究发现:它们都可以在无配体存在的情况下自发组装,并介导信号传递,引发细胞凋亡.其中在鉴定Fas发生三聚体化的实验中使用了FRET技术:将Fas分别与CFP与YFP融合,利用此项技术可以很方便的观测到Fas单体是否发生聚合.Yogesh Patel等人研究两种递质多巴胺与抑生长素.发现SSTR5(the type 5 somatostatin receptor)与D2R(type 2 dopamine receptor)共同分布在大鼠脑中的一些神经元中,他们将两者共表达,发现加入多巴胺能的激活剂能增强SSTR5与somatostatin的亲和性,加入多巴胺拮抗剂能抑制SSTR5的信号传递,表达D2R能恢复SSTR5突变体与腺苷环化酶的偶联.这不由是人们想到:两种受体之间是否存在某种联系呢?终于,应用FRET技术(SSTR5用红色染料标记,D2R用绿色染料标记)发现了两者之间的直接相互作用.而且当两受体的配体都存在时才出现FRET,说明两受体被激活时才发生相互作用.
4、细胞内分子之间相互作用
Rho家族的小G蛋白通过调节肌动蛋白的多聚化调控着重要的生理功能,象其他信号分子一样,这些GTPase的效应在时间和空间上都非常集中,那么如何检测它们活性的时空动力学呢? Klaus Hahn等在Science上报道了一种新的技术FLAIR(fluorescence activation indicator for Rho proteins)可很好的解决这个问题:他们将PAK1的能结合并激活Rac-GTP的domain PDB与荧光染料Alexa标记,微注射入表达GFP与Rac融合蛋白的细胞中.这样,当Rac与PDB相互作用时,GFP和Alexa就会足够接近以致发生FRET.这种方法能够实时的检测到在一个活的细胞中Rac的定位改变与Rac激活之间的关系.
Matsuda 等人在Nature上报道关于细胞内Ras和Rap1激活,也是用了FRET技术:他们将Ras和Raf的Ras结合结构域(Raf RBD)与GFP的突变种YFP和CFP进行融合构建.他们将Ras和YFP融合,RafRBD与CFP融合,当两分子靠的足够近时,它们之间就会激发FRET,设计的蛋白Raichu-Ras,Raichu代表和Ras结合的嵌合单元.当把Raichu-Ras与特异性的GEFs(guanine-nucleotide exchange factors)和GAPs(GTPase-activating proteins)共表达,清楚的显示FRET的增加和减少与Ras突变体的激活和抑制有关.此外他们还用同样原理观测了Rap1激活.
再问: 写了。
下面给出几个例子:
二、FRET技术的应用
随着生命科学研究的不断深入,对各种生命现象发生的机制,特别是对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用的研究变得尤为重要.而要想在这些方面的研究取得重大突破,技术进步又是必不可少的.一些传统的研究方法不断发展,为蛋白质-蛋白质间相互作用的研究提供了极为有利的条件,但同时这些研究手段也存在不少缺陷:如酵母双杂交、磷酸化抗体、免疫荧光、放射性标记等方法应用的前提都是要破碎细胞或对细胞造成损伤,无法做到在活细胞生理条件下实时的对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究.FRET技术的应用结合基因工程等技术正好弥补了这一缺陷,下面是FRET技术在相关生命科学领域中的具体应用.
1、检测酶活性变化
(1)活细胞内检测蛋白激酶活性
蛋白质磷酸化是细胞信号转导过程中的重要标志,研究其中的酶活性是研究信号通路的一个重要方面.以前酶活性测定主要是利用放射性以及免疫化学发光等方法,但前提都是要破碎细胞,用细胞提取物测定酶活性,还无法做到活细胞内定时、定量、定位的观测酶活性变化.而利用FRET方法就可以很好的解决这个问题:如zhang等人利用FRET原理设计了一种新的探针(一种融合蛋白):新探针包含一个对已知蛋白激酶特异性的底物结构域,一个与磷酸化底物结构域相结合的磷酸化识别结构域.这个探针蛋白的两端是GFP的衍生物CFP与YFP,利用FRET原理工作.当底物结构域被磷酸化后,分子内部就会发生磷酸化识别结构域与其结合而引起的内部折叠,两个荧光蛋白相互靠近就会发生能量迁移.如果磷酸酶进行作用将其去磷酸化,分子就会发生可逆性的变化.该研究小组[3-4]用几组嵌合体来研究四种已知蛋白激酶的活性:PKA(protein kinase A)、Src、Abl 、 EGFR(epidermal growth factor receptor).他们将构建的报导探针转入细胞,根据FRET来检测激酶活性变化.对细胞进行生长因子处理后,几种酪氨酸激酶都在几分钟内被激活,检测到25%-35%的活性变化.用forskolin激活PKA能增强FRET 25%-50%的变化,激酶在整个细胞质范围内被激活.如果将报导探针加上核定位信号使之定位于核中,则FRET变化被极大的延迟了,这也说明了PKA作用的区域性.由此可见,利用FRET方法可以很好的观察活细胞内酶活性变化,并且能做到定时、定量、定位,是一种非常有效的研究手段.
(2)关于细胞凋亡的研究
细胞凋亡过程大致可以分为三个不同的阶段:起始期—细胞通过不同途径接受多种与凋亡有关的信号;整合期—多种信号在此整合,细胞做出生存或死亡的决定;执行期—一旦做出死亡的决定,即将进入一个不可逆转的程序.天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific protease,Caspase)在细胞凋亡的执行期发挥关键作用,近年来对其研究成为细胞凋亡领域的一个热点.而FRET技术的出现对此的研究提供了更为有利的条件:Reiko Onuki等人利用FRET技术研究了Caspase8与Bid蛋白之间的相互作用,Caspase8活化后作用Bid蛋白,使其裂解成两个片段,然后羧基片段转移到线粒体使其释放细胞色素C诱发细胞凋亡.研究者将Bid蛋白两端分别与CFP与YFP融合,精心设计使其在没有被裂解前刚好可以发生FRET,当Bid蛋白被裂解后FRET效应自然消失.所以是一种很好的检测Caspase8酶活性方法,而且当Bid蛋白与CFP与YFP融合之后仍能行使正常的功能,当融合物在细胞内被裂解后,连接CFP的片段转移到线粒体,通过CFP荧光可以很清楚的观测到其在细胞内的定位.另外Markus Rehm[6]与 Kiwamu Takemoto[7]等人利用FRET技术设计了可以反映Caspase3酶活性变化的融合报告蛋白,通过此报告蛋白证实了在细胞凋亡过程中Caspase3酶活性变化是一个非常迅速的过程.
2、关于膜蛋白的研究
(1)受体激活效应在细胞膜上的横向扩散
膜蛋白的研究一直都是信号通路研究中的重点和难点.当细胞膜局部受外界刺激后,相应受体被激活然后向细胞内传导信号,可是在这之前是否会有细胞膜上的横向效应呢?近来Peter等人[8]在Science上报道:细胞膜局部受刺激后,膜受体活化效应可迅速扩展到整个细胞膜.他们将膜受体EGFR(epidermal growth factor receptor)与GFP融合,抗活化后的EGFR抗体用Cy3染料标记,刺激因子EGF(epidermal growth factor)用Cy5染料标记,这样可以很明显的看到EGF在细胞膜上的局部分布.当EGF作用细胞后,EGFR活化并与其抗体结合,于是GFP与Cy3染料充分接近发生FRET,利用此方法可以很明显的观测到细胞膜局部受刺激后,受体活化效应迅速扩散到整个细胞膜.
(2)膜蛋白的定位修饰
我们知道膜蛋白是定位在细胞膜上不同的亚区域中,例如脂质筏(lipid rafts)和小窝(caveolae),小窝包含着丰富胆固醇、鞘磷脂和信号蛋白.那么这些蛋白怎样到达它们的目的地呢?Zacharias等在Science上报道,酰基化足以使这些蛋白定位在脂质筏.他们的研究是通过FRET(fluorescence resonance energy transfer)技术,用GFP的突变体CFP(cyan fluorescent protein)和YFP(yellow fluorescent protein)来进行.因为这些蛋白并没有细胞内定位序列,所以研究者将各种酰基化修饰的敏感序列加在这些蛋白上,研究它们在细胞膜上的分布.因为分布的微结构域非常小,所以当CFP和YFP共分布在同一个微结构域时,就可以用FRET来观测到.研究者最初是用激酶Lyn的酰基化序列加在这些荧光蛋白上,使myristoyl和palmitoyl侧链链接在CFP和YFP的氨基端.结果发现产生的FRET信号非常强,用能去除胆固醇而使小窝和脂质筏消失的MCD(5-methyl-β-cyclodextrin)处理也不能使荧光消失,所以这说明荧光蛋白已经非常牢固的结合在了一起.然后研究者用荷电的基团代替荧光蛋白上疏水的基团时,发现聚体形成被抑制了.
3、细胞膜受体之间相互作用
外界刺激因素向细胞内的信号传递一般认为通过其在胞膜上的受体,当配体与受体结合后,引起受体构象变化或化学修饰,介导信号传递.但是最近关于Fas及其同源物TNFR(均为胞膜上的三聚体受体)的研究发现:它们都可以在无配体存在的情况下自发组装,并介导信号传递,引发细胞凋亡.其中在鉴定Fas发生三聚体化的实验中使用了FRET技术:将Fas分别与CFP与YFP融合,利用此项技术可以很方便的观测到Fas单体是否发生聚合.Yogesh Patel等人研究两种递质多巴胺与抑生长素.发现SSTR5(the type 5 somatostatin receptor)与D2R(type 2 dopamine receptor)共同分布在大鼠脑中的一些神经元中,他们将两者共表达,发现加入多巴胺能的激活剂能增强SSTR5与somatostatin的亲和性,加入多巴胺拮抗剂能抑制SSTR5的信号传递,表达D2R能恢复SSTR5突变体与腺苷环化酶的偶联.这不由是人们想到:两种受体之间是否存在某种联系呢?终于,应用FRET技术(SSTR5用红色染料标记,D2R用绿色染料标记)发现了两者之间的直接相互作用.而且当两受体的配体都存在时才出现FRET,说明两受体被激活时才发生相互作用.
4、细胞内分子之间相互作用
Rho家族的小G蛋白通过调节肌动蛋白的多聚化调控着重要的生理功能,象其他信号分子一样,这些GTPase的效应在时间和空间上都非常集中,那么如何检测它们活性的时空动力学呢? Klaus Hahn等在Science上报道了一种新的技术FLAIR(fluorescence activation indicator for Rho proteins)可很好的解决这个问题:他们将PAK1的能结合并激活Rac-GTP的domain PDB与荧光染料Alexa标记,微注射入表达GFP与Rac融合蛋白的细胞中.这样,当Rac与PDB相互作用时,GFP和Alexa就会足够接近以致发生FRET.这种方法能够实时的检测到在一个活的细胞中Rac的定位改变与Rac激活之间的关系.
Matsuda 等人在Nature上报道关于细胞内Ras和Rap1激活,也是用了FRET技术:他们将Ras和Raf的Ras结合结构域(Raf RBD)与GFP的突变种YFP和CFP进行融合构建.他们将Ras和YFP融合,RafRBD与CFP融合,当两分子靠的足够近时,它们之间就会激发FRET,设计的蛋白Raichu-Ras,Raichu代表和Ras结合的嵌合单元.当把Raichu-Ras与特异性的GEFs(guanine-nucleotide exchange factors)和GAPs(GTPase-activating proteins)共表达,清楚的显示FRET的增加和减少与Ras突变体的激活和抑制有关.此外他们还用同样原理观测了Rap1激活.
再问: 写了。
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